Impact de la privation et de la réoxygénation d’oxygène-glucose sur les interactions cellule-cellule

Résumé

Source : Alluri, H., et.al. Privation et réoxygénation d’oxygène-glucose en tant que modèle de lésion d’ischémie-reperfusion in vitro pour l’étude du dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique. J. Vis. Exp. (2015).

La vidéo démontre l’impact de la privation d’oxygène-glucose et de la réoxygénation ultérieure sur les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau du rat (RBMEC) en simulant des conditions hypoxiques et privées de nutriments. Ces conditions entraînent une appauvrissement en ATP, une augmentation du calcium intracellulaire et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui dégradent les protéines de jonction cellulaire et induisent la formation de fibres de stress, affaiblissant ainsi les interactions cellule-cellule.

Protocole

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p style='hauteur-de-ligne :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :12pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>1. Ensemencement des cellules endothéliales

1. Obtenez des cultures primaires de RBMECs à partir de rats Sprague Dawley adultes (ou obtenez-les commercialement).

2. Cultivez des RBMECs dans des boîtes de Pétri enrobées de fibronectine de 100 cm (50 μg/ml) en utilisant la croissance des cellules endothéliales du cerveau du rat Douleur moyenne. Changez le support tous les deux jours jusqu’à ce que la confluence soit atteinte.

3. Lorsque vous atteignez 80-90 % de confluence, lavez doucement les cellules dans 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en les remuant. Les cellules sont ensuite détachées en les exposant à 1 ml de solution chaude d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 %, équilibrée à 37 °C.

4. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 à 5 minutes jusqu’à ce qu’elles soient détachées et dispersées. NOTE : Tapotez la boîte de culture pour détacher les cellules. Visualisez les cellules au microscope pour confirmer le détachement complet des cellules de la surface de la parabole.

5. Ajouter 5 ml de milieu complet dans la boîte de Pétri afin de neutraliser la trypsine. Pipeter le milieu contenant les cellules détachées et le recueillir dans un tube à centrifuger de 15 ml.

6. Centrifuger le milieu contenant des cellules endothéliales à 220 x g pendant 5 min.

7. Aspirez le surnageant et conservez les cellules contenant la cuille. Suspendez la pastille dans 3 à 5 ml de milieu de croissance de cellules endothéliales de cerveau de rat frais en la mélangeant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette. Les cellules seront ensuite comptées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre.

8. Transférez la suspension cellulaire dans un système de lames stériles à 8 puits pré-enrobé de fibronectine (50 μg/ml), 0,7 cm²/puits avec une densité d’ensemencement variant entre 10 000 et 15 000 cellules par puits. Augmentez les cellules à 37 °C jusqu’à ce que la confluence soit obtenue NOTE : Pour effectuer des transferts occidentaux ou d’autres expériences, les cellules peuvent être cultivées dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm ou des boîtes spéciales selon les besoins de l’expérience.

2. Privation d’oxygène et de glucose-Réoxygénation In Vitro

Model

1. Utilisez le système de culture cellulaire d’hypoxie pour étudier les effets de l’OGD-R sur les RBMECs (voir Figure 1). Installez et calibrez le système de culture cellulaire d’hypoxie avant de commencer l’expérience, conformément aux instructions du fabricant.

2. Retirez les lames de la chambre confluente (étape 1.8) de l’incubateur à 37 °C. Remplacez le milieu complet dans la lame de chambre par du milieu modifié de Dulbecco (DMEM) désoxygéné, sans glucose, et placé dans une chambre d’hypoxie avec 95 % d’azote et 5 % de dioxyde de carbone pendant 2 h à 37 °C, pour représenter l’état des autres régions.

3. Ramenez les cellules dans l’incubateur avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone à 37 °C et pourvu d’un milieu complet de cellules endothéliales de cerveau de rat fraîches et incubez pendant encore 1 heure à 37 °C.

REMARQUE : Cette étape représente une situation de réoxygénation.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Proox model 110 Biospherix		Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal	Antibody Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, lames de verre	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondaire anticorps	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Tout autre PBS disponible peut être utilisé